Реакция обратной пассивной гемагглютинации. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (рнга, рпга)

Реакция ставится:

1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается,

2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)-группы крови человека)

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты . Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.

Рис. 3. Схема РПГА: эритроциты (1), нагруженные антигеном (3), связываются специфическими антителами (4).

Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.

Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис.4. Учет РНГА (РПГА).

Учет результатов рнга, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция торможения гемагглютинации (ртга).

Рис. 8. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).

Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток

Рис. 9. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка) ; - гемагглютинация (зонтик).

Выводы: Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2

Занятие 14

Тема: Непрямые серологические реакции. Реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), связывания комплемента (РСК).

Антитела

Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенами . Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Строение иммуноглобулинов . Наиболее “типичное” строение имеют IgG. Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями. Участок антитела, который связывается с антигеном, называется активным центром антитела. В молекуле IgG имеется 2 активных центра. Он образован N-концевыми участками тяжелой и легкой цепей. Участок тяжелых цепей, расположенный вблизи дисульфидных связей, называется шарнирной областью. С помощью фермента папаина молекула IgG выше шарнирной области расщепляется на 3 фрагмента: 2 из них содержат легкую цепь и часть тяжелой цепи (Fab-фрагменты); а третий фрагмент состоит только из части тяжелых цепей (Fc-фрагмент). Благодаря подвижной шарнирной области Fab-фрагменты могут изменять взаимное расположение в пространстве.

Аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей делятся на константные (постоянные) и вариабельные участки. Вариабельные участки находятся на N-концах легких и тяжелых цепей (VL и VH). Константные участки находятся на С-концах цепей (СL и СH). В легких и тяжелых цепях аминокислотные последовательности образуют несколько глобулярных структур, которые называются доменами.

Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп ), имеющую определенную конфигурацию и распределение электрических зарядов на своей поверхности. Размер, форма и распределение зарядов в активном центре определяет его специфичность, то есть способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом ), имеющей комплементарную структуру.

Антигенные детерминанты представляют собой участки, выступающие на поверхности молекул антигенов. Поэтому взаимодействие эпитоп-паратоп происходит по принципу “ключ-замок”.

Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой характеризуется понятием аффинность. Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты.

На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных имуноглобулинов. Важным свойством IgG является их способность проходить через плаценту. Таким образом, материнские антитела попадают в организм ребенка и защищают его в первые месяцы жизни от инфекции (естественный пассивный иммунитет).

К классу IgM относится около 10% общего пула иммуноглобулинов. Молекула IgM представляет собой пентамер, то есть состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой IgG, имеет 10 активных центров. Субъединицы соединены между собой дисульфидными связями. В молекуле IgM имеется дополнительная J-цепь, которая связывает субъединицы. Антитела класса IgM не проходят через плацентарный барьер.

Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов. Молекула IgА состоит из 2-х легких и 2-х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра. В сыворотке крови IgА присутствуют в мономерной форме, тогда как в секретах слизистых оболочек IgА представлены в виде димеров и называются секреторными или sIgА, имеют 4 активных центра. С-концы тяжелых цепей в молекуле sIgА соединены между собой J-цепью и белковой молекулой, которая называется секреторный компонент. Секреторный компонент защищает sIgА от расщепления протеолитическими ферментами, которые содержатся в большом количестве в секрете слизистых оболочек. Основная функция sIgА – защита слизистых оболочек от инфекции. IgА не проникают через плацентарный барьер. Высокая концентрация sIgА обнаруживается в женском грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочно-кишечный тракт новорожденного от инфекции.

IgD в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Имеют строение, подобное IgG, 2 активных центра. Биологическая роль до конца не известна.

IgЕ – концентрация этого класса иммуноглобулинов в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. По своему строению IgЕ сходен с IgG, имеет 2 активных центра. Предполагается, что IgЕ имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета. IgЕ играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма , сенная лихорадка) и анафилактического шока.

Реакция непрямой гемагглютинации

В непрямых серологических реакциях комплекс антигенов с антителами не виден невооруженным глазом. В таких случаях антигены адсорбируют на более крупных частицах-носителях (эритроцитах, частицах латекса), получая антигенный эритроцитарный диагностикум. Последующая агглютинация специфическими антителами таких частиц позволяет видеть агглютинат (осадок) невооруженным глазом. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) выявляет антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Эритроциты с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

РНГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Такую реакцию называют РОНГА – реакцией обратной непрямой гемагглютинации.

Компоненты РНГА:

Сыворотка крови больного (разведение 1:25);

Эритроцитарный диагностикум (эритроциты, нагруженные антигеном исследуемого возбудителя);

Промывной раствор.

Постановка РНГА. В семь лунок планшета для иммунологических исследований вносят по две капли фосфатного буферного раствора. В первую лунку прибавляют две капли сыворотки крови больного, после чего из первой лунки переносят 2 капли во вторую лунку, из второй – в третью и т. д. Из шестой лунки 2 капли удаляют. Во все семь лунок (6 опытных и 1 контрольную) прибавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Планшеты оставляют при комнатной температуре на 45 минут, после чего учитывают результаты.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соединении антигена с антителом образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Если комплекс антигена с антителом не образуется, то комплемент остается свободным. Свободный комплемент выявляется добавлением к смеси гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и антител против них. Положительная реакция – отсутствие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом антиген+антитело. Отрицательная реакция – наличие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом эритроцит+антиэритроцитарное антитело.

Компоненты РСК:

Сыворотка крови здорового;

Сыворотка крови больного (в разведении 1:5);

Антигенный компонент реакции - инактивированный возбудитель;

Комплемент в разведении, соответствующем рабочей дозе. Комплемент получают из сыворотки крови морской свинки. Титром комплемента является его минимальная доза, которая в присутствии гемолитической сыворотки вызывает полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза комплемента, используемая при постановке РСК, на 30% больше его титра;

Гемолитическая система - взвесь эритроцитов барана, обработанных кроличьими антителами к эритроцитам барана.

Промывочный раствор.

Постановка РСК. РСК ставят в двух пробирках – опытной и контрольной. В опытную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови больного, в контрольную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови здорового донора, в обе пробирки вносят по 0,5 мл лизата возбудителя, а также по 0,5 мл комплемента. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. После инкубации в обе пробирки вносят по 1,0 мл гемолитической системы. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. При положительной реакции в опытной пробирке отмечается задержка гемолиза (жидкость бесцветная и осадок эритроцитов), в контрольной пробирке – гемолиз эритроцитов.

Литература для подготовки к занятию:

1. Борисов микробиология, вирусология , иммунология. М., 2002.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. . М., 2004.

3. Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Серологический анализ крови представляет собой способ лабораторного исследования определенных антигенов или антител (специфических белков ) в сыворотке крови пациента, основанный на иммунных реакциях организма. Данный метод применяется при диагностике инфекционных заболеваний для выявления наличия антител в крови больного к определенному виду вирусов или бактерий , а также для определения групповой принадлежности крови.

Исследуемый материал

В первую очередь для проведения серологического анализа используют биологический материал, собранный от пациента:

• сыворотка крови
• слюна
• фекальные массы

В некоторых случаях исследуется материал, выделенный из определённых объектов окружающей среды:

• почва

Методика проведения анализа или забора крови

Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор крови проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам. Для серологического исследования забор крови производится двумя методами: венозную кровь забирают из локтевой вены пациента, а капиллярную кровь – из безымянного пальца. Кровь помещают в стерильные герметичные пробирки.

Особенности транспортировки крови и хранения сыворотки

Сразу же после забора крови её транспортируют в специальную лабораторию, где в тот же день производится подготовка сыворотки. Хранение сыворотки допускается не более 4 – 6 дней в холодильной камере при температуре 2 – 4 градусов. При необходимости более длительного хранения, сыворотка замораживается. Во избежание нарушения качества сыворотки допускается однократное её замораживание и, соответственно, размораживание. При длительном хранении антитела теряют свои свойства и становятся частично неактивными, наиболее чувствительными к замораживанию являются иммуноглобулины класса М . После размораживания сыворотки необходимо тщательное перемешивание её до однородной массы, что способствует восстановлению концентрации антител, содержащихся в данной сыворотке.

Для чего используют серологические исследования?

Серологические методы лабораторной диагностики используются для выявления таких заболеваний как эхинококкоз, трихинеллёз, токсокароз, описторхоз, цистицеркоз, токсоплазмоз , амебиаз, лямблиоз , для определения эффективности проведённого курса лечения и, наконец, для обнаружения повторного заболевания после полного выздоровления пациента.

Основные методы серологической диагностики

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Данная реакция является непрямым вариантом серологического исследования, то есть, производится она в два этапа. На первом этапе производят выявление необходимого антитела в циркулирующем комплексе антиген – антитело с помощью антиглобулина, схожего по своей структуре с белками иммунной сыворотки. Выявление искомого антитела возможно также при изучении заранее приготовленного антигенного препарата под люминесцентным микроскопом, без использования антиглобулинов.

Иммунофлюоресцентная реакция – очень трудоёмкий процесс, требующий от специалиста немало времени и ответственности. Начинается реакция с подготовки растворов, затем сыворотки и их контрольные образцы подвергаются титрованию (процесс, позволяющий определить содержание определённого вещества путём постепенного смешивания исследуемого раствора с контролируемым количеством реагента ). Подготовленные ранее разведения и их контрольные образцы аккуратно наносятся на предметные стёкла с антигеном. Потом препараты подвергаются инкубации, затем следует их отмывание и высушивание на воздухе. На стёкла с антигеном тонким слоем наносится антисыворотка, после этого производится вторичная инкубация препаратов и, вся предыдущая цепь действий повторяется, завершаясь высушиванием препарата. В результате препарат на предметном стекле подвергается обработке глицерином и исследуется в люминесцентном микроскопе.

Результаты проведённой реакции оцениваются по четырёх бальной шкале, которая характеризуется интенсивностью поверхностного жёлто-зелёного свечения клеток антигенов:
+ очень слабое свечение клетки, заметное только на её периферии
++ слабое свечение периферии клетки, но с явно заметным зелёным оттенком
+++/++++ яркое свечение зелёного цвета периферии клетки
Титром реакции считается такое разведение сыворотки, где не менее 50 % клеток антигена проявляют чёткое поверхностное свечение, то есть результат реакции +++ или ++++ . Значение тира реакции от 1/80 до 1/100.

Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне образованных лунок:
– отрицательная реакция, которая характеризуется осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»
+ слабая интенсивность, для данной реакции характерны небольшие одиночные отложения на дне лунки. Неагглютинированные эритроциты образовывают «маленькое колечко» в центре лунки
++ средняя интенсивность, ей свойственно образование на дне лунки «широкого плотного кольца» из неагглютинированных эритроцитов
+++ интенсивная реакция, агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтики», в центре которых, явно видны кольца, образованные осевшими неагглютинированными эритроцитами
++++ резко интенсивная реакция, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуя «зонтики», выстилают дно лунок.
Титром данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее +++ , то есть при интенсивной или резко интенсивной реакции.

Достоверность и качество методов серологической диагностики зависят от организации проведённого внутреннего и внешнего лабораторного контроля, состоящих из нескольких независимых процедур, предназначенных для оценки качества результатов проведённого анализа.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме­няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби­рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше­нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых план­шетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положитель­ной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кру­жевного зонтика», при отрицательной реакции - плотный осадок эрит­роцитов в виде "пуговки".

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс­ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос­тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от­ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген па­лочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Реакция Кумбса (аптиглобулиновый тест)

Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh + эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антите­ла не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антите­лами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроци­тов.

Реакция преципитации

Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реак­ции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции пре­ципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осто­рожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципи­тата.

Реакцию применяют в судебной медицине для определения видо­вой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических ис­следованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммуниза­ции животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кро­лика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наи­большее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.

Реакция преципитации в агаровом геле проводится несколькими ме­тодами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.

Реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтерлони). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердевания в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммун­ные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встре­чи преципитат в виде белых полос.

Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини). В растоп­ленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антиге­на, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических мо-норецепторных сыворотках.

Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направ­лению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образуются линии преципитации.

Реакции иммунного лизиса

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфи­ческими антителами, образует иммунный комплекс, к которому при­соединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эрит­роциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, ан­титела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лако­вую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для об­наружения комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант ре­акции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют ком­племент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Рис. 34. Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). А - получение эритроцитарного диагностикума: Б - РПГА: 1 - эритроцит: 2 - изучаемый антиген; 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену: 5 - агглютинат

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

Контрольные вопросы

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

Задание

Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.

Реакция преципитации

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.

* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).

4. Изотонический раствор.

Таблица 19. Схема реакции гемолиза

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).

Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.

Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.

Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.

Похожая информация.