Използването на combibest тест за диагностика на HIV. Съвременни методи за диагностициране на ХИВ инфекция Какво да очаквате от резултатите от ХИВ

Обща информация за изследването

ХИВ (вирус на човешкия имунодефицит) е вирус от семейството на ретровирусите, който инфектира клетките на човешката имунна система (CD4, Т-хелпери). Предизвиква СПИН.

ХИВ-1 е най-често срещаният тип вирус, най-често срещан в Русия, САЩ, Европа, Япония и Австралия (обикновено подтип В).

ХИВ-2 е рядък тип, често срещан в Западна Африка.

За диагностициране на вируса на човешкия имунодефицит се използва комбинирана тестова система от четвърто поколение, която е в състояние да открие ХИВ инфекция още 2 седмици след навлизането на вируса в кръвта, докато тестовите системи от първо поколение правят това само 6-12 седмици. след инфекция.

Предимството на този комбиниран тест за ХИВ е откриването, благодарение на използването на антитела срещу HIV-1 p24 като реагенти, на специфичния р24 антиген (вирусен капсиден протеин), който може да бъде открит с този тест вече 1-4 седмици след заразяването, т.е. дори преди сероконверсия, което значително намалява "периода на прозореца".

В допълнение, такъв тест за ХИВ открива антитела срещу ХИВ-1 и ХИВ-2 в кръвта (с помощта на реакцията антиген-антитяло), които се произвеждат в достатъчни количества, за да бъдат определени от тестовата система след 2-8 седмици от момента на инфекция.

След сероконверсия, антителата започват да се свързват с р24 антигена, което води до положителен тест за HIV антитяло и отрицателен тест за p24. Въпреки това, след известно време, едновременно антитела и антиген ще бъдат открити в кръвта. В терминалния етап тестът за СПИН за антитела срещу ХИВ може да даде отрицателен резултат, тъй като механизмът за производство на антитела е нарушен.

Етапи на HIV инфекция

1. Инкубационният период или „периодът на серонегативния прозорец“ е времето от момента на инфекцията до производството на защитни антитела срещу вируса в кръвта, когато тестовете за антитела срещу ХИВ са отрицателни, но човекът вече може да предаде вируса на други хора. Продължителността на този период е от 2 седмици до 6 месеца.
2. Периодът на остра ХИВ инфекция настъпва средно 2-4 седмици след заразяването и продължава приблизително 2-3 седмици. На този етап някои хора могат да развият неспецифични грипоподобни симптоми поради активното възпроизвеждане на вируса.
3. Латентният стадий протича безсимптомно, но по време на него се наблюдава постепенно намаляване на имунитета и увеличаване на количеството на вируса в кръвта.
4. СПИН (Синдром на придобита имунна недостатъчност) е крайният стадий на ХИВ инфекцията, който се характеризира с тежко потискане на имунната система, както и съпътстващи заболявания, енцефалопатия или рак.

Въпреки факта, че ХИВ инфекцията е нелечима, днес съществува високоактивна антиретровирусна терапия (АРТ), която може значително да удължи живота на ХИВ-инфектиран човек и да подобри неговото качество.

Този тест има особено висока диагностична стойност, ако ХИВ инфекцията е настъпила малко преди момента на изследването (2-4 седмици).

За какво се използва изследването?

Анализът се използва за ранна диагностика на ХИВ, което помага за предотвратяване на по-нататъшно предаване на вируса на други хора, както и за навременно започване на антиретровирусна терапия и лечение на заболявания, които допринасят за прогресирането на ХИВ инфекцията.

Кога е насрочено проучването?

• Със стабилни симптоми (за 2-3 седмици) с неясна етиология: субфебрилна температура, диария, нощно изпотяване, внезапна загуба на тегло, подути лимфни възли.
• С повтаряща се херпесна инфекция, вирусен хепатит, пневмония, туберкулоза, токсоплазмоза.
• Ако пациентът страда от полово предавани заболявания (сифилис, хламидия, гонорея, генитален херпес, бактериална вагиноза).
• Ако пациентът е имал незащитен вагинален, анален или орален секс с множество сексуални партньори, нов партньор или партньор, чийто ХИВ статус пациентът не е сигурен.
• Когато пациентът е претърпял процедура за кръвопреливане (въпреки че случаите на инфекция по този начин са практически изключени, тъй като кръвта е внимателно тествана за наличие на вирусни частици и се подлага на специална топлинна обработка).
• Ако пациентът е инжектирал лекарства с помощта на нестерилни инструменти.
• Бременност/Планиране на бременност (Приемането на азидотимидин по време на бременност, цезарово сечение, за да се избегне предаването на вируса на бебето по време на преминаване през родовия канал, и липсата на кърмене намаляват риска от предаване на ХИВ от майка на дете от 30% на 1%).
• Случайно инжектиране със спринцовка или друг предмет (като медицински инструмент), съдържащ заразена кръв (в такива случаи вероятността от инфекция е изключително ниска).

Навременната диагноза на ХИВ инфекцията става изключително важна мярка, тъй като по-ранното лечение може до голяма степен да определи по-нататъшното развитие на заболяването и да удължи живота на пациента. През последните години се наблюдава значителен напредък в областта на откриването на това ужасно заболяване: старите тестови системи се заменят с по-модерни, методите за изследване стават все по-достъпни и тяхната точност се увеличава значително.

В тази статия ще говорим за съвременни методи за диагностициране на ХИВ инфекция, които е полезно да знаете за навременното лечение на този проблем и поддържане на нормалното качество на живот на пациента.

Методи за диагностициране на ХИВ

В Русия за диагностициране на ХИВ инфекция се провежда стандартна процедура, която включва две нива:

• ELISA тестова система (скрининг анализ);
• имунно блотинг (IB).

Могат да се използват и други диагностични методи:

• експресни тестове.

ELISA тестови системи

На първия етап от диагнозата се използва скрининг тест (ELISA) за откриване на HIV инфекция, който се основава на HIV протеини, създадени в лаборатории, които улавят специфични антитела, произведени в тялото в отговор на инфекция. След взаимодействието им с реагентите (ензимите) на тестовата система цветът на индикатора се променя. Освен това тези промени в цвета се обработват на специално оборудване, което определя резултата от извършения анализ.

Такива ELISA тестове са в състояние да покажат резултати в рамките на няколко седмици след въвеждането на HIV инфекцията. Този анализ не определя наличието на вируса, а открива производството на антитела към него. Понякога в човешкото тяло производството на антитела срещу ХИВ започва след 2 седмици след заразяването, но при повечето хора те се произвеждат на по-късна дата, след 3-6 седмици.

Има четири поколения ELISA тестове с различна чувствителност. През последните години все по-често се използват тестови системи от III и IV поколение, които са базирани на синтетични пептиди или рекомбинантни протеини и имат по-голяма специфичност и точност. Те могат да се използват за диагностициране на ХИВ инфекция, наблюдение на разпространението на ХИВ и осигуряване на безопасност при тестване на дарената кръв. Точността на ELISA тест системите от III и IV поколение е 93-99% (по-чувствителни са тестовете, които се произвеждат в Западна Европа - 99%).

За провеждане на ELISA тест се вземат 5 ml кръв от вената на пациента. Между последното хранене и анализа трябва да мине най-малко 8 часа (като правило се извършва сутрин на празен стомах). Такъв тест се препоръчва да се направи не по-рано от 3 седмици след предполагаемата инфекция (например след незащитен полов акт с нов сексуален партньор).

Резултатите от ELISA теста се получават след 2-10 дни:

• отрицателен резултат: показва липса на HIV инфекция и не изисква насочване към специалист;
• фалшиво отрицателен резултат: може да се наблюдава в ранните етапи на инфекцията (до 3 седмици), в късните стадии на СПИН при тежка имунна супресия и при неправилна подготовка на кръвта;
• фалшиво положителен резултат: може да се наблюдава при някои заболявания и при неправилна подготовка на кръвта;
• положителен резултат: показва инфекция с HIV инфекция, изисква IB и насочване на пациента към специалист в център за СПИН.

Защо ELISA тестът може да даде фалшиво положителни резултати?

Фалшиво положителни резултати от ELISA тест за ХИВ могат да се наблюдават при неправилна обработка на кръвта или при пациенти със следните състояния и заболявания:

• множествена миелома;
• инфекциозни заболявания, провокирани от вируса на Epstein-Barr;
• състояние след ;
• автоимунни заболявания;
• на фона на бременност;
• състояние след ваксинация.

Поради причините, описани по-горе, в кръвта могат да присъстват неспецифични кръстосано реагиращи антитела, чието производство не е провокирано от HIV инфекция.

През последните години честотата на фалшиво положителни резултати значително намаля поради използването на тест системи от III и IV поколение, които съдържат по-чувствителни пептидни и рекомбинантни протеини (те са синтезирани с помощта на in vitro генно инженерство). След използването на такива ELISA тестове честотата на фалшиво положителни резултати е намаляла значително и е около 0,02-0,5%.

Фалшиво положителен резултат не означава, че човек е заразен с ХИВ. В такива случаи СЗО препоръчва друг ELISA тест (задължително IV поколение).

Кръвта на пациента се изпраща в референтна или арбитражна лаборатория с надпис "повторение" и се тества с IV поколение ELISA тестова система. Ако резултатът от новия анализ е отрицателен, тогава първият резултат се признава за грешен (фалшиво положителен) и IB не се извършва. Ако резултатът е положителен или съмнителен по време на втория тест, пациентът трябва да се подложи на IB след 4-6 седмици, за да потвърди или отхвърли HIV инфекцията.

имунно блотиране

Окончателната диагноза на ХИВ инфекцията може да се постави само след получаване на положителен резултат от имунно блотинг (IB). За изпълнението му се използва нитроцелулозна лента, върху която се нанасят вирусни протеини.

Вземането на кръв за IB се извършва от вена. След това се подлага на специална обработка и протеините, съдържащи се в серума му, се отделят в специален гел според заряда и молекулното им тегло (манипулацията се извършва на специално оборудване под въздействието на електрическо поле). Върху гела на кръвния серум се нанася нитроцелулозна лента и се извършва попиване („блотиране“) в специална камера. Лентата се обработва и ако използваните материали съдържат антитела срещу HIV, те се свързват с антигенните ленти на IB и се появяват като линии.

IB се счита за положителен, ако:

• според американските критерии на CDC - има две или три линии gp41, p24, gp120 / gp160 на лентата;
• според американските критерии на FDA - има две линии p24, p31 и линия gp41 или gp120 / gp160 на лентата.

В 99,9% от случаите положителен резултат от IB показва HIV инфекция.

При липса на линии - IB е отрицателен.

При идентифициране на линии с gp160, gp120 и gp41, IB е съмнително. Такъв резултат може да бъде открит, когато:

• онкологични заболявания;
• бременност;
• чести кръвопреливания.

В такива случаи се препоръчва да се извърши второ проучване с помощта на комплект от друга компания. Ако след допълнителен IB резултатът остане съмнителен, тогава е необходимо проследяване в продължение на шест месеца (IB се извършва на всеки 3 месеца).

полимеразна верижна реакция

PCR тестът може да открие РНК на вируса. Чувствителността му е доста висока и позволява откриване на ХИВ инфекцията още 10 дни след заразяването. В някои случаи PCR може да даде фалшиво положителни резултати, тъй като неговата висока чувствителност може да реагира и на антитела срещу други инфекции.

Тази диагностична техника е скъпа, изисква специално оборудване и висококвалифицирани специалисти. Тези причини не позволяват провеждането му при масово тестване на популацията.

PCR се използва в такива случаи:

• за откриване на ХИВ при новородени, родени от ХИВ-инфектирани майки;
• за откриване на ХИВ в „периода на прозореца“ или при съмнителна IB;
• да контролира концентрацията на ХИВ в кръвта;
• за изследване на донорска кръв.

Само чрез PCR теста диагнозата ХИВ не се поставя, а се извършва като допълнителен диагностичен метод за разрешаване на спорове.

Експресни методи

Една от иновациите в диагностиката на ХИВ са бързите тестове, резултатите от които могат да бъдат оценени за 10-15 минути. Най-ефективните и точни резултати се получават с имунохроматографски тестове, базирани на принципа на капилярния поток. Те представляват специални ленти, върху които се нанася кръв или други тестови течности (слюнка, урина). При наличие на антитела срещу ХИВ след 10-15 минути на теста се появява цветна и контролна лента - положителен резултат. Ако резултатът е отрицателен, се появява само контролната линия.

Както при ELISA тестовете, резултатите от бързия тест трябва да бъдат потвърдени чрез IB анализ. Само тогава може да се постави диагноза ХИВ инфекция.

Има експресни комплекти за домашно тестване. Тестът OraSure Technologies1 (САЩ) е одобрен от FDA, отпуска се без рецепта и може да се използва за откриване на ХИВ. След теста, в случай на положителен резултат, пациентът се препоръчва да се подложи на преглед в специализиран център за потвърждаване на диагнозата.

Останалите тестове за домашна употреба все още не са одобрени от FDA и техните резултати могат да бъдат много съмнителни.

Въпреки факта, че бързите тестове са по-ниски по точност на ELISA тестовете от IV поколение, те се използват широко за допълнително изследване на населението.

Можете да се изследвате за ХИВ инфекция във всяка поликлиника, ЦРБ или в специализирани центрове за СПИН. На територията на Русия те се държат абсолютно поверително или анонимно. Всеки пациент може да очаква да получи медицински или психологически съвет преди или след анализа. Ще трябва да плащате за тестове за ХИВ само в търговски медицински заведения, а в държавни клиники и болници те се извършват безплатно.

За информация как можете да се заразите с ХИВ и какви митове съществуват относно възможностите да се заразите, прочетете

ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ, ELISA - английски) навлиза в живота на практическата медицина някъде другаде през 60-те години на миналия век. Първоначалната му задача е хистологично изследване за научни цели, което се свежда до търсене и идентифициране на антигенната структура на клетките на живия организъм.

Методът ELISA се основава на взаимодействието на специфични (AT) и свързани антигени (AG) с образуването на комплекс антиген-антитяло, който се открива с помощта на ензим. Този факт навежда учените на идеята, че методът може да се използва за диагностични цели за идентифициране на специфични имуноглобулини от различни класове, участващи в имунния отговор към конкретна инфекция. И това беше пробив в клиничната лабораторна диагностика!

Методът започва да се използва активно едва в началото на 80-те години, а след това основно в специализирани институции. Кръвопреливащи центрове и станции, инфекциозни и венерологични болници бяха снабдени с първите ензимни имуноанализатори, тъй като ужасният СПИН, роден на африканския континент, се появи на хоризонта с нас и веднага се присъедини към „старите“ инфекции, изискваше незабавни мерки за диагностициране и търсене на терапевтични лекарства, които го засягат.

Обхват на метода ELISA

Възможностите на ензимния имуноанализ са наистина обширни.Сега е трудно да си представим как може да се направи без такива изследвания, които се използват буквално във всички клонове на медицината. Изглежда, че ELISA може да направи в онкологията? Оказва се, че може. И много. Способността на анализа да открие маркери, характерни за някои видове злокачествени новообразувания, е в основата на ранното откриване на тумор, когато все още не е открит с други методи поради малкия си размер.

Съвременната клинична лабораторна диагностика (CDL), в допълнение към туморните маркери, разполага със значителен арсенал от панели за ELISA и ги използва за диагностициране на различни патологични състояния (инфекциозни процеси, хормонални нарушения) и наблюдение на фармацевтичните лекарства с цел идентифициране на ефекта им върху състоянието на пациента. тялото и, между другото, не само човек. В момента ензимният имуноанализ се използва широко във ветеринарната служба, тъй като "нашите по-малки братя" също са податливи на много заболявания, от които понякога страдат много.

По този начин, ELISA, поради своята чувствителност и специфичност, може да определи от кръвна проба, взета от вена:

• Хормонален статус (тиреоидни и надбъбречни хормони, полови хормони);
• Наличието на вирусна и бактериална инфекция (HIV, B и C, хламидия, сифилис и, както и много други заболявания, причинени от патогенни микроорганизми);
• Следи от жизнена активност на микроорганизми, които инициираха инфекциозния процес, който завърши успешно и премина към етапа на формиране на имунен отговор към този патоген. Такива следи, тоест антитела, в много случаи остават да циркулират в кръвта за цял живот, което предпазва човек от повторно заразяване.

Каква е същността на IF?

Методът на ензимния имуноанализ дава възможност да се определи не само наличието на самия патоген (качествен анализ), но и неговото количествено съдържание в кръвния серум на пациента.

Вирусна или бактериална доза оказва значително влияние върху протичането на инфекциозния процес и неговия изход, така че количественият анализ играе важна роля в диагностиката и лечението на заболявания в различни форми и етапи.

Въпреки това, знаейки ензимно-свързаните имуносорбентни анализи като ELISA метод, ние дори не се замисляме как той успява да обхване толкова широк спектър от микроорганизми, обитаващи нашата планета, много от които представляват пряка заплаха за здравето и живота на хората и животни. Факт е, че ELISA има много опции (неконкурентни и конкурентни - директни и косвени), всяка от които решава свой собствен проблем и по този начин дава възможност за целенасочено търсене.

За откриване на имуноглобулини от един или друг клас се използва традиционен 96-ямков полистиролен панел (таблетка), в чиито ямки се концентрират адсорбирани рекомбинантни протеини в твърдата фаза. Антителата или антигените, попаднали в ямката с кръвен серум, намират „познат“ обект и образуват с него комплекс (AG - AT), който, фиксиран от ензимния конюгат, ще се прояви като промяна в цвета на ямката при четене на резултатите.

Ензимният имуноанализ се извършва на тестови системи с определена специфичност, направени в специални лаборатории и оборудвани с всички необходими реагиращи компоненти. Изследванията могат да се извършват с помощта на шайби ("шайби") и отчитащи спектрофотометри, където е включен повечето ръчен труд. На напълно автоматични машини, които освобождават лаборанта от монотонно насаждане, миене и други рутинни задачи, разбира се, е по-бързо и по-удобно да се работи, но не всички лаборатории могат да си позволят такъв лукс и продължават да работят по старомоден начин - на полуавтоматични устройства.

Интерпретацията на резултатите от ELISA е в компетенциите на лекаря по лабораторна диагностика, като задължително се взема предвид свойството, присъщо на почти всички имунохимични реакции да дават фалшиво положителни или фалшиво отрицателни отговори.

Видео: съвременен ензимен имуноанализ

Резултатите от ELISA са на примера на сифилис

ELISA е подходящ за откриване на всички формии освен това се използва при скринингови проучвания. За анализ се използва венозна кръв на пациента, взета на празен стомах. В работата се използват плочи с определена специфичност (AT класове A, M, G) или тотални антитела.

Като се има предвид, че антителата при сифилис се произвеждат в определена последователност, ELISA може лесно да отговори на въпроса кога е възникнала инфекцията и на какъв етап е процесът, а декодирането на получените резултати може да бъде представено в следната форма:

• IgM показват продължителността на инфекциозния процес (може да се появи по време на обостряне на хронични възпалителни заболявания);
• IgA заявяват, че инфекцията е станала преди повече от месец;
• IgG показват, че инфекцията е в разгара си или скорошно лечение, което лесно се установява при събиране на анамнеза.

При тестване за сифилис, отрицателните ямки (и отрицателната контрола) ще останат безцветни, докато положителните (като положителната контрола) ще покажат ярко жълт цвят поради промяната на цвета на хромогена, добавен по време на теста. Въпреки това, интензитетът на цвета не винаги съответства на контрола, тоест може да бъде леко по-блед или леко жълтеникав. Това са съмнителни резултати, които по правило подлежат на повторно изследване със задължителното отчитане на количествените показатели, получени на спектрофотометър, но като цяло цветът е пряко пропорционален на броя на имунните комплекси (антигени и антитела, свързани с взаимно).

Най-вълнуващият ензимен имуноанализ - ELISA за HIV

Анализът на може би повече от други представлява интерес за широк кръг от населението, тъй като все още не е възможно да се каже със сигурност, че много социални проблеми (проституция, наркомания и др.) са изчезнали. За съжаление, ХИВ засяга не само тези части от човешкото общество, можете да се заразите при различни обстоятелства, които не са свързани със сексуален промискуитет или употреба на наркотици. Но ако има нужда от тест за ХИВ, тогава не трябва да се страхувате, че всички наоколо ще разберат за посещение на такава лаборатория. Сега заразените с ХИВ са защитени от закона, а тези, които се съмняват, могат да се обърнат към анонимни служби, където могат да решат проблема без страх от публичност и осъждане.

Ензимният имуноанализ, използван за диагностициране на HIV инфекция, е едно от основните стандартни изследвания, които обаче изискват специални условия, тъй като темата е много чувствителна.

Има смисъл да се провежда ELISA за ХИВ след сексуален контакт, кръвопреливане, други медицински процедури, които включват инфекция, и в края на инкубационния период („серонегативен прозорец“), но трябва да се има предвид, че този период от време не е постоянна. Може да приключи за 14-30 дни или може да продължи до шест месеца, така че средната стойност се счита за интервал от 45 до 90 дни. Кръвта се дарява за ХИВ по същия начин, както при други инфекции – от вена на гладно. Резултатите ще бъдат готови в зависимост от натрупването на материал в лабораторията и натовареността й (от 2 до 10 дни), въпреки че повечето лаборатории дават отговор на същия ден или на следващия.

Какво може да се очаква от резултатите за ХИВ?

ELISA за HIV инфекция открива антитела срещу два вида вирус: HIV-1 (по-често срещан в Русия и други европейски и азиатски страни) и HIV-2 (по-често срещан в Западна Африка).

Задачата на HIV ELISA е да търси антитела от клас G, които се откриват във всички тестови системи, но в по-късен период, и антитела от клас A и M, открити върху ново поколение рекомбинантни тестови комплекти, които дават възможност за откриване на антитела при най-ранните етапи (инкубационният период е серонегативен прозорец). Следните отговори могат да се очакват от ELISA:

1. Първичен положителен резултат: кръвта подлежи на повторна проверка на тест-система от същия тип, но по възможност от друга серия и от друго лице (лаборант);
2. Повторното (+) включва ново вземане на кръвна проба от пациент с изследване, подобно на първичния анализ;
3. Следващият положителен резултат подлежи на референтен анализ, при който се използват високоспецифични тестови комплекти (2-3 бр.);
4. Положителен резултат и в двете (или три) системи се изпраща за имуноблотинг (същият ELISA, но се извършва индивидуално върху тестови комплекти с особено висока специфичност).

Заключението за ХИВ инфекция се прави само въз основа на имуноблотинг. Със заразеното лице се провежда разговор при пълна конфиденциалност. Разкриването на медицински тайни в Русия, както и в други страни, подлежи на наказателно наказание.

Тестовете за хламидия и цитомегаловирус чрез ензимен имуноанализ също придобиха особена популярност, поради факта, че ви позволяват да определите времето на инфекция, стадия на заболяването и ефективността на терапевтичните мерки.

По време на въвеждането също е възможно да се наблюдава появата на антитела от различни класове.в различни фази на патологично състояние, причинено от инфекциозен агент:

• IgM могат да бъдат открити още седем дни след заразяването;
• IgA показват, че инфекцията живее в тялото повече от месец;
• IgG потвърждава диагнозата на хламидия, помага да се наблюдава лечението и да се определи неговата ефективност. Трябва да се отбележи, че антителата от клас G остават и циркулират в тялото независимо от продължителността на заболяването, следователно, за правилното тълкуване на анализа, трябва да се вземат предвид референтните стойности (норми), които чрез начина, са различни за всеки CDL: като се вземе предвид марката на тестовата система и спецификата на реагентите, включени в комплекта. Нормалните стойности се въвеждат във формуляра до резултата от ELISA.

Що се отнася до, тук е малко по-различно:антителата от клас М се появяват след около месец и половина, тоест положителен резултат (IgM +) става във фазата на първична инфекция или по време на реактивиране на латентна инфекция и остава такъв от 4 месеца до шест месеца.

Наличието на антитела от клас G е характерно за началото на първична остра инфекция или реинфекция. Анализът посочва, че вирусът е налице, но не дава информация за етапа на инфекциозния процес. Междувременно определянето на нормата на титъра на IgG също създава затруднения, тъй като зависи изцяло от имунния статус на конкретно лице, което обаче се установява чрез откриване на имуноглобулини от клас G. Предвид това поведение на антителата, при диагностициране на CMVI става необходимо за оценка на способността на антителата от клас G да взаимодействат с CMV, за да го „неутрализират“ по-късно (AT avidity). В началния стадий на заболяването IgG се свързва много слабо с антигените на вируса (ниска авидност) и едва тогава те започват да проявяват активност, следователно можем да говорим за повишаване на авидността на антителата.

Можем да говорим за предимствата на ензимния имуноанализ дълго време, тъй като този метод успя да реши много диагностични проблеми, използвайки само венозна кръв. Няма нужда от дълго чакане, притеснения и проблеми с вземането на материал за изследване. Освен това тестовите системи за ELISA продължават да се подобряват и денят, в който тестът ще даде 100% надеждност на резултата, не е далеч.

Видео: образователен филм на Московския държавен медицински университет. Сеченов за основите на ELISA

Собствениците на патент RU 2283497:

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите и медицината. Ензимен имунодефицитен тест система за идентифициране на спектъра от антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус (HIV) от първи и втори тип, първи тип от група О и откриване на антигена на човешкия имунодефицитен вирус от първи тип p24 включва имуносорбент на основата върху антигени на човешкия имунодефицитен вирус, представляващи gp41 (env HIV-1 и HIV-2 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), антитела срещу HIV антигена 1 p24 и реагенти за откриване, докато горните HIV антигени и HIV антитела се адсорбират в различни ямки на плаки за ензимен имуноанализ, а 96-ямкови полистиролови сгъваеми или несгъваеми плаки се използват за сорбция. Изобретението осигурява повишена чувствителност, опростяване, изключване на субективността на оценката на резултатите. 1 z.p. f-ly, 10 tab., 1 ill.

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите и медицината. Употреба: диференцирано откриване на всички класове специфични антитела срещу протеини на човешки имунодефицитен вирус 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген.

Същност: получаване на система за ензимен имуноанализ за идентифициране на спектъра от антитела от всички класове към отделни протеини и HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген в кръвен серум (плазма), имуноглобулини и кръвни продукти с цел идентифициране спектърът от антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O, откриване на HIV 1 p24 антиген и потвърждаване на положителни или неопределени резултати от скрининга за антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген.

ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Лабораторната диагностика на ХИВ инфекцията се основава на три области: а) индикация на ХИВ и неговите компоненти; б) откриване на антитела срещу ХИВ; в) определяне на промените в имунната система. Сред съществуващите методи за лабораторна диагностика най-често срещаните са серологичните методи - откриване на антитела срещу вирусни антигени.

За откриване на антитела при HIV инфекция се използват основно ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и имуноблотинг (IB). ELISA се основава на имобилизирането на вирусни антигени върху плочи, които свързват антителата на пациента, а комплексът антиген-антитяло се открива с помощта на конюгирани с пероксидаза от хрян миши моноклонални антитела към човешки имуноглобулини G и M. Методът е доста специфичен и чувствителен и позволява да се открият вирус-специфични антитела при 95% от пациентите. Останалите 5% от случаите се появяват в ранните стадии на инфекцията, когато все още има малко антитела в кръвния серум, или в терминалните фази на заболяването, когато тялото вече не е в състояние да синтезира антитела поради рязко изчерпване на имунната система. Възможни са и фалшиво положителни резултати от ELISA, главно при пациенти с автоимунни и онкологични заболявания, както и при инфекции, причинени от вируса Eshptein-Barr. В този случай има кръстосана реакция на антитела срещу ревматоиден фактор, вирус на Epstein-Barr или антигенни детерминанти, подобни на протеини от главния комплекс за хистосъвместимост клас 1 и 2 (HLA-4 и DQW3) и имащи способността да се свързват с HIV антигени. Фалшиво положителни резултати често се наблюдават при бременни жени и възрастни хора. Хемолиза, липемия, бактериално замърсяване на серумите също могат да бъдат причина за ненадеждни резултати.

В тази връзка са предложени и използвани редица методи за тестване на специфичността на резултатите от откриването на антитела. От тези методи най-често използваната реакция е „имунно блотиране“ в модификацията на „Western Blot“. Същността на метода е следната: на първия етап HIV протеините се разделят по молекулно тегло с помощта на електрофореза в полиакриламиден гел. Това е последвано от електрофоретичен трансфер от полиакриламидния гел към повърхността на нитроцелулозната мембрана. Пренесените по този начин антигени се откриват върху мембраната чрез индиректен анализ: мембраната се инкубира с тестовия материал; съдържащите се антитела се свързват с HIV антигени, прехвърлени към нитроцелулозна мембрана, след което мембранните ленти се инкубират с конюгата; когато се образува комплекс антиген-антитяло, конюгатът се прикрепя към него, след измиване от конюгата и инкубиране със субстрата, оцветяването на тези участъци от нитроцелулоза се появява, където се получава образуването на комплекс антиген-антитяло-конюгат. Чертежът показва примери за положителни, слабо положителни и отрицателни резултати от имуноблотиране.

В серума на лица, заразени с HIV-1 и HIV-2, се откриват антитела към следните протеини (p) и гликопротеини (gp): Таблица A.

Таблица Б представя критериите за оценка на резултатите от имунното блотиране, препоръчани от СЗО и Руския център за превенция и контрол на СПИН.

Въз основа на критериите на СЗО, серумите се считат за положителни, ако антитела към всеки два протеина на обвивката на HIV-1 са открити чрез IB метода. Ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp160, gp120, gp41), в комбинация с реакция с други протеини или без нея, резултатът се счита за съмнителен. Според Федералния научно-методологичен център на Министерството на здравеопазването на Руската федерация за превенция и контрол на СПИН, е възможно да се интерпретират серумите като положителни дори при наличие на антитела само към протеина на една обвивка.

Откриването на антитела срещу р24 антигена може да показва периода на началото на сероконверсията, тъй като антителата към този протеин се появяват първи. Положителните реакции с gag и pol протеини без реакция с env протеини могат да отразяват етапа на ранна сероконверсия, както и да показват наличието на HIV-2 инфекция или неспецифична реакция.

Използването на имуноблотинг като експертен метод за диагностициране на ХИВ има редица значителни недостатъци:

1. Невъзможността за потвърждаване на откриването на p24 антигена на HIV 1 в случай на използване на тестове, които едновременно определят антигена и антителата срещу HIV, което прави неподходящо (безсмислено) използването на скрининг тестове за едновременно откриване на антиген и антитела към ХИВ (Заповед на Министерството на здравеопазването на Руската федерация № 292 от 30.07. 2001 г.: "за да се изследват донорите в станциите за кръвопреливане, е необходимо да се използват тестови системи, които откриват както антиген, така и антитела срещу ХИВ").

2. Откриване на антитела само от клас IgG. Невъзможно е напълно да се потвърдят положителните резултати, получени с помощта на тестове от 3-то и 4-то поколение (откриване на IgG и IgM антитела).

3. Субективността на интерпретацията на резултата от теста, особено в случаите на „съмнителни“ и „несигурни“ резултати и в началните етапи на сероконверсия (откриваемите ленти върху нитроцелулозните мембрани в тези случаи са размити, едва видими с просто око и често има разногласия, когато се оценяват от различни лица).

4. Невъзможността за автоматизирана количествена оценка на резултатите от анализа.

5. По-ниска чувствителност в сравнение с ELISA.

6. Крехкост на съхранение (по време на съхранение лентите от нитроцелулозна мембрана избледняват и не могат да бъдат обективно потвърждение за откриване или неоткриване на ХИВ в спорни случаи).

7. Трудност при настройване на реакцията и съхранение (лентите на нитроцелулозната мембрана са много крехки и често се чупят).

8. Висока цена на комплектите IS.

Известен реагент, който е комплект за едновременно определяне на антигени и антитела към един и същ патоген, включително HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Въпреки това не е разкрита тестова система, която позволява диагностициране на ХИВ инфекция на различни етапи.

Целта на настоящото изобретение е да се получи тестова система, с която е възможно да се потвърдят положителни или съмнителни резултати от скрининг тестове за антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген, като се използват тестове за едновременно откриване на антигени и антитела.

Предложеното техническо решение се постига чрез ензимна имуноанализна тестова система за идентифициране на спектъра на антителата срещу вируса на човешкия имунодефицит (HIV) от първи и втори тип, първи тип група О и откриване на р24 антиген към вируса на човешката имунна недостатъчност от първия тип p24, характеризиращ се с това, че включва имуносорбент на базата на антигени на човешкия имунодефицитен вирус, които са gp41 (env HIV-1 и HIV-2 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), антитела срещу HIV антиген 1 p24 и реагенти за откриване, където горните HIV антигени и HIV антитела се адсорбират в различни ямки на плаки за ензимен имуноанализ.

В допълнение, 96-ямкови полистиролови сгъваеми или несгъваеми плочи за ензимен имуноанализ се използват за сорбция.

Техническият резултат, постигнат с настоящото изобретение, е възможността за потвърждаване на положителни резултати за антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген, висока чувствителност, възможност за автоматизирана интерпретация на резултатите, което елиминира субективността на оценката, лекотата на провеждане на теста, по-малко, отколкото при съществуващите комплекти IS на разходите.

Това техническо решение се различава от известните:

1. Използвайте като твърда фаза носеща плоча за имунологични реакции.

2. Едновременно използване на антитела срещу p 24 HIV и набор от HIV антигени като сорбент.

Изобретението се илюстрира със следния пример.

Активният принцип на разработената тест система "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" са:

Имуносорбент - рекомбинантни антигени, подобни на структурните протеини на HIV-1: gp41 (env HIV-1 и HIV 1 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) и моноклонални миши антитела към антигена на HIV 1(p24), адсорбирани отделно върху ленти от полистиролова сгъваема плоча.

За приготвяне на имуносорбент използвайте:

1. HIV-1 gp41 е протеин, произведен от щам E. Coli No AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 е протеин, произведен от щам E. Coli No AHIV 109.

3. HIV-1 p24 - протеин, произведен от щам E. Coli No AHIV 105.

4. HIV-1 p31 - протеин, произведен от щам E. Coli No AHIV 108.

5. HIV-2 p36 - протеин, произведен от щам E. Coli No AHIV 106.

Конюгат 1, лиофилизиран или течен, миши моноклонални антитела срещу HIV1 p24 антиген, конюгиран с биотин.

1. Конюгат 2, лиофилизиран или течен, смес от рекомбинантни антигени, подобни на структурните протеини на HIV-1: gp41 (env HIV-1 и HIV 1 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (po1 ); HIV-2: gp36 (env), конюгиран с биотин;

2. Конюгати 3, 4 - лиофилизирани или течни - стрептавидин, белязан с пероксидаза от хрян;

В хода на предварителни проучвания беше избран дизайнът на тест-системата, разработена е технологията за приготвяне на нейните компоненти, оптимизирани са условията за провеждане на ензимния имуноанализ.

При настройване на ELISA в тестовата система "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", 25 μl конюгат-1 се добавят към ямките на плаката с адсорбирани антитела към p24 и в ямките с адсорбирани антигени - 25 µl конюгат-2. Реакционната схема е показана по-долу. След това към всяка ямка се добавят 25 μl от тестовата проба. В същото време в ямките с антигени цветът се променя от оранжево до розово, а в ямката с антитела от зелено към сиво. Сместа се инкубира в продължение на 45 минути при 37°С на шейкър (или 1 час при 37°С в термостат). След това, без промиване, 50 μl конюгат-3 се добавят към ямките на таблетката за определяне на р24 антигена и 50 μl конюгат-4 се добавят към ямките за определяне на антитела. След инкубиране в продължение на 20 минути при 37°C на шейкър (или 30 минути при 37°C в термостат), плаката се измива и се проявява със субстратната смес. Общо време за реакция 1 час 25 минути (или 1 час 50 минути). Антигенът р24, присъстващ в тестовата проба, се свързва с моноклонални антитела към р24, а специфичните антитела образуват комплекс с рекомбинантни антигени върху плаката. Полученият имунен комплекс анти-р24 с р24 се открива с анти-р24-биотинови конюгати, след това със стрептавидин-пероксидаза, а имунните комплекси на Ag-HIV с At-HIV се откриват с Ag-биотин конюгат, след това със стрептавидин-пероксидаза .

Схема за настройка на реакцията.

Отчитането на резултатите се извършва спектрофотометрично при две дължини на вълната: 450 /620-680 nm с инструмента, настроен на "въздух". Нека вземем предвид резултатите при една дължина на вълната от 450 nm.

Резултатите от анализа се вземат предвид, ако средните стойности на оптичната плътност (OD) в ямките с K- са не повече от 0,2, в ямките с K+ - не по-малко от 1,0. ОП крит. изчислено по формулата:

ОП крит. gp41 = вж. стойност OP K-(gp41)+0,15

ОП крит. gp120 = вж. стойност OP K-(gp120)+0,15

ОП крит. p24 = вж. стойност ОП К-(р24)+0,15

ОП крит. p31 = вж. стойност ОП K-(р31)+0,15

ОП крит. gp36 = вж. стойност OP K-(gp36)+0,15

ОП крит. Ag p24 = вж. стойност OD към- (Ag p24)+0,04

където 0,15 и 0,04 са коефициенти, установени по метода на статистическа обработка при производителя. В процеса на разработване на тестовата система бяха използвани следното:

1. Проби от кръвен серум от здрави донори (n=610).

2. Кръвни серумни проби на пациенти с различни инфекциозни заболявания, несвързани с ХИВ (ОРЗ, пневмония, тонзилит, херпетични и цитомегаловирусни инфекции, сифилис, хламидия, вирусен хепатит А, В и С (n=224)).

3. Кръвни серумни проби на пациенти с различни незаразни заболявания – травми, заболявания на сърдечно-съдовата система, онкология (n=35).

4. Проби от кръвен серум от бременни жени (n=40).

5. Проби от кръвен серум, серопозитивни в ELISA и потвърдени в имуноблот (n=428).

6. Серумни проби с положителен резултат, получени в системи за ензимен имуноанализ за едновременно определяне на HIV 1,2 антитела и р24 антиген, и неопределен имуноблот резултат (n=123).

7. Вътрешен панел от серуми, съдържащи и несъдържащи антитела срещу HIV 1.2, тествани с ензимни имуноанализове, регистрирани от Министерството на здравеопазването на Руската федерация и имуноблот (n=21).

8. Стандарт "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Франция, кат. № 72217, който е антиген, получен от вирусен лизат.

9. Вътрешният стандарт на предприятието. Проба, съдържаща р 24 антиген в концентрация 200 pg/ml, получена от вирусен лизат и титрирана по "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" фирма "BIO RAD", Франция, кат. № 72217.

10. Стандартен панел от серуми, съдържащи антитела към човешкия имунодефицитен вирус от първи тип (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, Медико-биологичен съюз, Новосибирск.

11. Стандартен панел от серуми, съдържащи антитела към човешкия имунодефицитен вирус от втори тип (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, Медико-биологичен съюз, Новосибирск.

12. Стандартен панел от серуми, които не съдържат антитела срещу вируса на човешкия имунодефицит от първи и втори тип (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, Медико-биологичен съюз, Новосибирск.

Оценката на чувствителността на тест системата за откриване на р24 антигена е извършена с помощта на стандарта "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", вътрешния стандарт на предприятието. Използвайки вътрешния стандарт, се приготвят 4 последователни 2-кратни разреждания от 40 pg/mL до 5 pg/mL с нормална донорна плазма, свободна от антитела срещу HIV 1, 2 като разредител. Като критерий за чувствителност е взето най-малкото количество откриваем антиген. Получените данни са представени в таблица 1.

За оценка на чувствителността на тестовата система за откриване на специфични антитела са използвани стандартни панели от проби, съдържащи антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P стр.012, OSO 42-28-216- 02P (HIV 2) стр.003).

Получените данни са представени в таблици 3, 4.

Диагностичната ефективност на тест системата "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" беше сравнена с тест системите "Jenscrin-HIV-Ag/Am" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostics of HIV Uniform II Ag/Am" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1.2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1.2 K" (Amercard) , " ХИВ-1, ХИВ-2-ELISA-Авицена" (Авицена). За тази цел серумните проби от вътрешния панел бяха тествани във всички посочени тестове. Резултатите, представени в Таблица 5, показват високата диагностична ефективност на "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1".

Изследвания за чувствителност на тестовата система "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" също бяха проведени с кръвни серуми на пациенти, потвърдени в имуноблота като HIV позитивни. Тествани са общо 428 проби от тези серуми. Получени са няколко варианта за откриване на антитела срещу различни HIV протеини и р24 антиген. Резултатите са представени в таблица 6.

При тестване на HIV 1 положителни проби, 3% от серумите показват положителна реакция с gp36 (env HIV 2). MP/OPcrit в тези проби не надвишава 2,0. Нашите данни за кръстосаната реактивност на протеините на външната обвивка на HIV 1 (gp41) и HIV 2 (gp36) са в съответствие с литературните данни.

Интерпретация на резултатите

Анализът на тестване на HIV-позитивни серуми и проби от стандартни и вътрешни панели в "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" направи възможно разработването на критерии за интерпретиране на резултатите от този тест. Препоръчителните критерии са показани в Таблица 7.

Въз основа на тези критерии, всички проби от ХИВ положителни серуми (n=428) бяха идентифицирани като положителни в "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1". От 16 проби от стандартния панел, съдържащи антитела срещу HIV 1, 14 бяха определени като положителни и 2 като неопределени. Всички 8 проби от стандартния панел, съдържащи антитела срещу HIV 2, бяха определени като положителни. От 10 проби от вътрешния панел, съдържащи антитела срещу HIV 1, 7 бяха идентифицирани като положителни и 3 като неопределени.

Изследвания на чувствителността на тест-системата "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" също бяха проведени с кръвни серуми на пациенти с положителен резултат в ензимни имуноанализни тестови системи, които едновременно откриват антитела и р24 антиген, и неопределен в имуноблота. Тествани са общо 123 такива проби. Данните са представени в таблица 8.

При тестване на серуми с неопределен имуноблот резултат (n=123) в "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1", 72 проби (58,5%) показват положителен резултат. От тях 26 серуми (21,1%) са положителни само за p24, 20 (16,3%) - само за антитела, 16 (13%) - за p24 с антитела към един от протеините, 10 (8,1%) - за p24 с антитела срещу два или повече от протеините. По този начин, тестването само за антитела (без откриване на p24) би довело до 30 проби (24,4%) да бъдат положителни. Откриването на р24 антигена в теста даде възможност да се определят като положителни допълнителни 42 проби (34,1%).

За оценка на специфичността на тестовата система се използва стандартен панел от серуми, несъдържащи антитела срещу HIV 1, 2 (n=20); кръвни серумни проби от здрави донори (n=610), проби от кръвен серум от пациенти с различни инфекциозни заболявания (n=224), които не са свързани с ХИВ; кръвни серумни проби на пациенти с различни незаразни заболявания - наранявания, заболявания на сърдечно-съдовата система, онкология (n=35); кръвни серумни проби от бременни жени (n=40). Тествани са общо 929 проби. Една проба от кръвни серуми на здрави донори показа фалшиво положителен резултат - открити са антитела срещу gp41 и p24. 7 проби кръвни серуми от здрави донори и 2 проби кръвни серуми от пациенти с инфекциозни заболявания, които не са свързани с ХИВ, показват фалшиво положителен резултат за p24.

За оценка на специфичността на тестовата система беше използван стандартен панел с отрицателни проби (OSO 42-28-214-94-02p, стр. 009). Специфичността беше 100%.

По този начин проучванията показват, че специфичността на тестовата система "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" е 99% при изследване на проби от кръвен серум на нормални донори и пациенти с различни инфекциозни и соматични заболявания .

Получените данни показват високата диагностична ефективност на разработената тест система "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1". Тестовата система може да се използва за откриване на антитела срещу отделни протеини на HIV тип 1 и 2 и антигена на HIV1 p24, за да се потвърди положителен резултат от скрининга с тест системи, които откриват антитела, или тест системи, които едновременно откриват антитела и HIV1 p24 антиген. Тест системата може да се използва като алтернативен имуноблот тест за потвърждаване на положителни резултати, както и за изследване на динамиката на антителата срещу HIV и p24 антигена в различни етапи на инфекцията.

ПРЕДИМСТВА ОТ ТЕСТА

1. Формат на плака за потвърдителен ензимен имуноанализ

2. Потвърждаващ тест, комбиниращ HIV 1, 2 спектър на антитела и HIV 1 p24 антиген

3. Откриване на антитела от всички Ig класове

4. Чувствителността за откриване на p24 е не по-малка от 5 pg/ml

5. Намалява неопределените резултати в сравнение с имуноблота

6. Време за анализ - 1 час 25 минути (имуноблот - от 3 до 20 часа)

7. Визуална оценка на въвеждането на всички компоненти и проби.

1. ELISA тестова система за идентифициране на спектъра от антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус (HIV) от първи и втори тип, първи тип от група О и откриване на р24 антигена към човешкия имунодефицитен вирус от първи тип р24, характеризиращ се с това, че включва имуносорбент на базата на антигени на имунодефицитен вирус gp41 (env HIV-1 и HIV-2 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), антитела към HIV антигена 1 p24 и реагенти за откриване, докато горните HIV антигени и HIV антитела се адсорбират в различни ямки на плаки за ензимен имуноанализ.

2. ELISA тестова система съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че 96-ямкови полистиролови сгъваеми или несгъваеми плаки за ензимен имуноанализ се използват за сорбция.